Умный редактор генов

Сначала коротко

В этом году лауреатами стали биолог Эммануэль Шарпентье (Emmanuelle Charpentier) и биохимик Дженнифер Дудна (Jennifer A. Doudna) «за разработку методов редактирования генома». Они внесли решающий вклад в раскрытие молекулярных механизмов системы бактериального иммунитета CRISPR-Cas и создали на её основе универсальные ножницы для правки геномов в клетках любых живых существ.

Теперь подробнее

Нобелевская премия по химии в 2020 году стала уникальным событием — впервые все её лауреаты женщины. До этого такое случалось лишь один раз — в 1911 году была награждена Мария Кюри, но тогда она была в гордом одиночестве. А вот другая особенность выбора лауреатов уже давно не удивляет — раз за разом Нобелевский комитет игнорирует химию как таковую и вручает премии за достижения в области молекулярной биологии. То же самое произошло и сейчас.

Эммануэль Шарпентье и Дженнифер Дудна оказались в числе тех редких счастливчиков, кого почести настигли практически сразу после совершенных ими открытий. Многие учёные ждут своей премии полвека, а некоторые и вовсе до неё не доживают. Исключения в наше время редки, но показательны: Андрей Гейм и Константин Новосёлов за изобретение графена, да команда первооткрывателей гравитационных волн.

Юрий Рубцов,
доцент базовой кафедры Института биоорганической
химии им. академиков М.М. Шемякина
и Ю.А. Овчинникова РАН в НИУ ВШЭ

Читать комментарий

Инструмент, который придумали Эммануэль Шарпентье и Дженнифер Дудна — CRISPR-Cas9 — достаточно быстро получил практическое применение. У него есть большие перспективы в медицине, потому что редактирование мутантных клеток и врожденных дефектов открывает возможности лечения орфанных заболеваний, с которыми долгое время человечество просто не представляло как бороться. А теперь, при условии соблюдения определенных этических норм и достаточной точности можно вылечить людей с мышечной дистрофией Дюшенна или хореей Гентингтона и другими ранее неизлечимыми заболеваниями. 

Мне не совсем понятно, почему премию дали двум, а не трём учёным. В Гарвардском университете работает замечательный китайский исследователь Фэн Чжан (Fēng Zhāng). Он первый предположил, что бактериальные системы защиты от бактериофагов можно переместить в клетки эукариот, в том числе, млекопитающих и человека, а также показал, как они работают. Хотя можно сказать, что его работа скорее биологическая, чем химическая. 

Эммануэль Шарпентье открыла гены, которые бактерии могут использовать как систему иммунитета для борьбы с разнообразными бактериофагами. А Дженнифер Дудна помогла ей охарактеризовать систему белков и ферментов, уничтожающих вирусную ДНК в клетках бактерий, которые уже встречались с бактериофагом и почему-то выжили. 

Они сделали предсказательную, теоретическую и биохимическую работу и поэтому им дали Нобелевскую премию в области химии. Хотя всё, что касается практического применения, лежит в плоскости биологии или медицины. 

В любом случае, премия абсолютно заслуженная, и это редкий случай, когда люди, которым нет 60 лет, получают Нобелевскую премию. Как правило, с момента открытия проходит 25-30 лет, а здесь главное открытие было сделано в 2012-2015 годах, и сегодня они уже стали лауреатами. Это беспрецедентно.

То, что сейчас принято называть геномными ножницами или геномным редактированием, изучается последние 40 лет. Один из подходов исследует семейство белков (нуклеазы с цинковыми пальцами), которые можно также программировать на узнавание определенных последовательностей генома. Работа заключалась в создании уникального белка, который бы узнавал и разрезал только определенную последовательность в геноме, для которой он и был создан. 

Это как действия хорошего портного по подгонке костюма для конкретного клиента, чтобы он идеально сидел. Здесь такая же ситуация, есть последовательность генов и нужно было сделать два белка, которые бы её узнавали и вырезали. Это трудоемкая технология, требует введения большего количества материала в клетку, при этом достаточно малоэффективная. Но специфичность её очень высока. Есть примеры успешного использования для редактирования генома клеток и даже отдельных организмов.

Эммануэль Шарпентье и Дженнифер Дудна предложили альтернативный подход. В нём система нацеливания нуклеаз разрезает ДНК с помощью рибонуклеиновой кислоты небольшого размера. Это значительно облегчает подбор молекул, которые направляют резку. Здесь совершенно другой принцип с более высокой эффективностью. Хотя есть вопросы к точности работы столь сложного инструмента.

Совместная работа Шарпентье и Дудны, посвященная исследованиям нового инструмента для генной инженерии — молекулярных ножниц CRISPR-Cas9 — вышла в 2012 году. Всего за восемь лет она совершила революцию в молекулярной биологии, биотехнологиях и биомедицине. Дала новые возможности для создания генно-модифицированных растений, терапии рака и даже редактирования эмбрионов человека. Подарила надежду на избавление от наследственных заболеваний и породила в обществе страхи о новых «островах доктора Моро». 

О чём это?

Когда мы говорим об иммунитете, то чаще всего подразумеваем способность организма человека противостоять бактериям и вирусам. Тем не менее, не только нам приходится сражаться с патогенами. Например, даже у бактерий есть свои вирусы — фаги, а также защищающая от них своеобразная система адаптивного иммунитета CRISPR-Cas. 

Столкнувшись с нападением вируса, но по каким-либо причинам выжив после него, некоторые бактерии, а также археи встраивают кусочки фагового генома в собственную ДНК. При этом встраивание происходит в строго определенное место, так называемый локус CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). По сути, этот участок в геноме прокариот словно особая кассета, на которую записаны «генетические фотороботы» — образцы ДНК — всех «преступников»-вирусов, когда-либо вторгавшихся в клетку. Биологи называют такие «генетические фотороботы» спейсерами. Чтобы они не перепутались между собой, спейсеры чередуются со специальными регулярно повторяющимися участками-вставками. Благодаря наличию спейсеров, бактерии «помнят» о том, с какими фагами они уже сталкивались и эффективней противостоят им в ходе повторных заражений. 

Основу любой жизни на Земле составляет генетическая информация. Она закодирована в двух типах молекул — РНК (у простых организмов, типа вирусов) и ДНК (у более сложных, включая человека). ДНК состоит из множества элементарных кирпичиков — нуклеотидов, таких как аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Разные их комбинации составляют отдельные гены, каждый из которых кодирует какой-либо белок или иную функциональную молекулу, определяющую рост, развитие и жизнедеятельность организма. Вся совокупность генов одного организма называется геномом. Условно говоря, в геноме человека полностью зашифровано его строение, особенности физиологии, способности и даже болезни. Геном можно прочитать. Эта операция называется секвенированием, а результат — сиквенсом. Теперь же — и прицельно отредактировать с помощью CRISPR-Cas9.

Помимо этого, обычно в непосредственной близости к локусу CRISPR в геноме бактерий располагаются гены cas. Они кодируют белки, необходимые как для захвата новых спейсеров, так и для борьбы с вирусами.

Как изучали?

История открытия системы CRISPR-Cas началась в 1987 году, когда учёные из Университета Осаки опубликовали статью, в которой впервые обратили внимание на короткие повторы ДНК в геноме Escherichia coli (кишечной палочки), разделённые уникальными спейсерами одинаковой длины. Впоследствии подобные локусы были найдены и в геномах других бактерий, но их функция долгое время оставалась неизвестной. Лишь в 2005 году появились данные о возможных источниках происхождения спейсеров. Три независимых группы исследователей сравнили последовательности ДНК спейсеров с геномами различных организмов и обнаружили, что большинство спейсеров представляют собой кусочки геномов фагов. Эти наблюдения натолкнули учёных на мысль о возможном участии CRISPR в ещё неизвестном на тот момент механизме бактериального иммунитета. 

В 2007 году в журнале Science была опубликована статья с первыми экспериментальными данными об участии CRISPR в защите бактерий от вирусов. Учёные под руководством Филиппа Хорвата заражали бактерии Streptococcus thermophilus фагом, после чего отбирали клетки, сумевшие пережить атаку вируса. Оказалось, что такие клетки выживают благодаря встраиванию в локус CRISPR новых спейсеров, комплементарных фаговой ДНК. Удалив такие спейсеры из генома бактерий, учёным удалось показать, что клетки повторно становятся чувствительными к вирусу. Таким образом, сомнений больше не осталось — именно наличие спейсеров обуславливает устойчивость бактерий к вирусам. Однако никто не понимал, каков механизм работы всей этой молекулярно-генетической машинерии.

Параллельно, начиная с 2002 года, Эммануэль Шарпентье исследовала в Венском университете (Австрия) другую крайне враждебную человеку бактерию Streptococcus pyogenes. Каждый год она поражает миллионы людей, вызывая как довольно легко излечимые заболевания, вроде тонзиллита или импетиго, так и опасный сепсис, — причину отказа множества внутренних органов, часто приводящую к гибели пациента. Из-за этого Streptococcus pyogenes нередко называют «пожирателем плоти».

Исследования носили вполне практический характер: почему эта бактерия столь агрессивна? Как она становится устойчивой к применяемым против неё антибиотикам? И можно ли найти новый способ борьбы с ней? Для ответа на все эти вопросы требовалось понять молекулярные механизмы — как регулируется экспрессия и работа генов Streptococcus pyogenes.

Многие люди характеризуют Шарпентье как целеустремлённую, внимательную и тщательную исследовательницу. Другие говорят, что она всегда в поисках неожиданного. Сама же она часто повторяет девиз Луи Пастера: «Удача благоволит подготовленному уму». Стремление к новым открытиям и желание быть свободной и независимой направляли карьерную траекторию Шарпентье. Начиная с докторантуры в Институте Пастера в Париже, она жила в пяти странах, семи разных городах и работала в десяти научных учреждениях.

В своих неустанных поисках Шарпентье в 2009 году сменила уютную Вену на позицию в шведском Университете Умео, чтобы более подробно изучить активно участвующие в работе молекулярно-генетической машинерии молекулы РНК. Совместно с исследователями из Берлина ей удалось полностью описать РНК, обнаруженные в Streptococcus pyogenes. Полученные результаты поставили перед ней новые вопросы, так как один из вариантов молекулы РНК экспрессировался внутри бактерий в огромных количествах, однако его функции оставались неизвестными. Понятно было только то, что он как-то связан со необычным локусом CRISPR в бактериальном геноме.

Всё это заставило Шарпентье продолжить исследования именно в этом направлении. Тщательный анализ генетического кода показал, что часть исследуемой молекулы РНК комплементарна регулярно повторяющимся участкам локуса CRISPR, словно два кусочка пазла. Сама Шарпентье до этого момента не имела опыта работы с CRISPR, но под влиянием своей исследовательской группы согласилась детально прояснить механизмы этой системы.

В настоящий момент её относят ко второму типу. Всего же, согласно классификации 2015 года, выделяют пять типов CRISPR-Cas систем. Их объединяет схожий принцип работы, тогда как отдельные механизмы и состав белков Cas, входящих в ту или иную систему, могут отличаться.

Выяснилось, что для разрезания вирусной ДНК используется один из белков Cas — Cas9. Кроме того, Шарпентье показала, что та самая неизвестная молекула РНК имеет решающее значение. Она необходима для того, чтобы другая — очень длинная РНК, — созданная на основе последовательности CRISPR в геноме (crRNA), перешла в активную форму. Поэтому ранее загадочную РНК назвали tracrRNA (trans-activating crispr RNA). 

После многочисленных экспериментов Эммануэль Шарпентье в марте 2011 года опубликовала работу о tracrRNA. Она понимала, что находится на пороге какого-то грандиозного открытия, весь её многолетний опыт в микробиологии говорил об этом. Однако для дальнейших исследований системы CRISPR-Cas ей требовалось сотрудничество с биохимиком, имеющим опыт исследований РНК. Шарпентье решила предложить сотрудничество Дженнифер Дудне. Тем более, что обстоятельства свели их вместе весной того же года на конференции в Пуэрто-Рико.

Дудна занималась исследованиями РНК с 1986 года, а к 2006-му уже возглавляла целую исследовательскую группу по этому вопросу в Калифорнийском университете в Беркли (США). Она имела репутацию успешного учёного с хорошим нюхом на прорывные проекты, что и, вероятно, побудило её в те годы заняться новой для себя областью — РНК-интерференцией, или процессом подавления экспрессии генов на стадии транскрипции (считывания информации из ДНК) и трансляции (синтеза белка на основе генетического кода) при помощи малых молекул РНК.

Ещё будучи ребёнком, росшим на Гавайях, Дженнифер всегда проявляла желание познать суть вещей. Однажды отец положил рядом с её кроватью автобиографическую книгу Джеймса Уотсона «Двойная спираль». Это беллетризованное описание гонки лабораторий в поисках структуры молекулы ДНК больше походило на лихой детектив и ни капли не напоминало упорядоченные сведения из школьных учебников Дудны. Оказалось, что наука это не только факты. Процесс поиска научной истины навсегда очаровал юную Дженнифер.

Поэтому, когда в 2006-м ей позвонила коллега из другого департамента и рассказала о загадке малых молекул РНК, это вызвало у неё любопытство. Многие годы биологи считали, что понимают базовые функции РНК, но обнаружение множества малых молекул, помогающих регулировать активность генов в клетке, поставило новые проблемы. По словам коллеги, никто не понимал механизм их работы, но существовала гипотеза, что ответы можно найти в работе системы иммунитета бактерий CRISPR и РНК-интерференции. 

Взволнованная, Дудна тут же начала читать всё, что вышло к этому моменту по CRISPR. Выяснилось, что помимо сиквенсов локусов CRISPR, исследователи обнаружили особые гены, которые они назвали CRISPR-ассоциированными (CRISPR-associated) или сокращенно cas. Но самое интересное — эти гены оказались очень похожими на другие — хорошо изученные — и связанные с раскручиванием и разрезанием ДНК. Так может, задала сама себе вопрос Дудна, у cas такая же функция, но режут они ДНК вирусов?

Через несколько лет экспериментов команда Дудны подтвердила эту догадку. Её исследования влились в поток других работ, описывающих механизмы CRISPR-Cas. Де-факто, Дудна описала первый тип систем CRISPR-Cas. Вторую, как мы помним, параллельно изучала Шарпентье. Их встреча уже была предопределена.

Что получили?

Конференция в Пуэрто-Рико была в самом разгаре. На второй день, после окончания заседаний, Дудну и Шарпентье представили друг другу в одном из кафе. Эммануэль предложила Дженнифер вместе прогуляться по старому городу. Понемногу на мощеных улицах завязался разговор об их текущих исследованиях. Наконец, Шарпентье прямо спросила, заинтересована ли Дудна в сотрудничестве — совместном изучении функций Cas9 в простой системе CRISPR-Cas второго типа у Streptococcus pyogenes? Дженнифер дала своё согласие.

Совместно они разработали план эксперимента. Учёные предположили, что полученные с CRISPR РНК (crRNA) необходимы для идентификации ДНК вируса, а Cas9 — это ножницы для его резки. Однако в опытах в пробирках гипотеза не подтверждалась. Молекулы ДНК оставались нетронутыми. Но почему? Что-то неправильно в самом эксперименте или всё же у Cas9 полностью иные функции?

После множества обсуждений и большого числа провальных опытов, Шарпентье и Дудна решили добавить в «молекулярный коктейль» ещё и tracrRNA. Ранее они считали, что эта молекула необходима лишь для того, чтобы транскрипт — РНК, считанный с локуса CRISPR (crRNA) — принял активную форму. Однако когда Cas9 и tracrRNA оказались вместе, произошло долгожданное событие — молекула ДНК оказалась разрезанной на две части.

Как действует иммунная система стрептококков

И вот, в 2012 году в журнале Science была опубликована сенсационная статья. Группа Дженнифер Дудны и Эммануэль Шарпентье показала, что белок Cas9, выделенный из бактерий Streptococcus pyogenes, является эндонуклеазой, то есть ферментом, способным разрезать ДНК. Однако при этом Cas9 неспособен самостоятельно найти мишень. 

Чтобы помочь ему в поисках нужного участка, в клетке синтезируются две молекулы РНК: tracrRNA и crRNA, содержащая спейсер. Именно комплекс Cas9-tracrRNA-crRNA находит мишень и вносит двухцепочечный разрыв. При этом архитектура комплекса такова, что концы молекул РНК расположены очень близко друг к другу. Дудна и Шарпентье «сшили» близко расположенные концы, получив таким образом единую молекулу sgRNA (single guide RNA). В результате ученым удалось показать, что для разрезания генома в определенном месте достаточно всего двух компонентов: белка Cas9 и sgRNA, которая направляет эндонуклеазу к мишени за счет входящего в её состав спейсера.

У бактерий это работает так:

В клетке синтезируются белки Cas и длинная crRNA, содержащая несколько повторов и спейсеров. Длинный транскрипт разрезается на короткие crRNA, каждая из которых соответствует одному спейсеру. Для разрезания длинной crRNA необходимы белки Cas, хотя в некоторых случаях в процессе участвуют и другие молекулы (например, tracrRNA и РНКаза III в системах второго типа).

Cas белки образуют комплекс с crРНК, который «ищет» чужеродные последовательности, комплементарные спейсеру. Важную роль в этом процессе играют последовательности PAM (protospacer adjacent motif) — мотив, смежный с протоспейсером — они есть в геноме вирусов, но отсутствуют в геноме бактерии. Эти последовательности позволяют отличить «своё» от «чужого». Как только враг обнаружен, белки Cas разрезают чужеродную ДНК на участке, комплементарном спейсеру.

Для чего это нужно?  

Очень быстро Дудна и Шарпентье поняли, что подобная система может работать не только для обеспечения иммунитета у бактерий, но и для редактирования генома других живых существ. Для этого из всех белков Cas учёные отобрали один-единственный Cas9. Затем сконструировали молекулу-переносчик — плазмид. Это кольцевая молекула ДНК, в которую встроены гены Cas9 и CRISPR-кассета с одним или несколькими спейсерами для генов, которые требуется исправить или удалить. 

Плазмид вводят в клетку, там он транскрибируется, полученная РНК вновь делится на отдельные спейсеры, соединенные с белком Cas9. РНК-спейсеры находят в ДНК нужные гены, а Cas9 их прицельно вырезает. Активно помогают процессу ремонтные системы клетки — они либо «сшивают» участок с образовавшейся лакуной (что позволяет полностью удалить вредоносный ген), либо ставят «заплатку» (в этом случае «плохой» ген можно заменить на его «хороший» вариант).

Впрочем, технологии редактирования геномов существовали и до открытия систем CRISPR-Cas. Они были разработаны на основе белков с цинковыми пальцами или белков TALE. Каждый домен в таких белках специфично связывается с одним или несколькими нуклеотидами. Комбинируя домены с различной специфичностью, можно получать белки, способные узнавать самые разные последовательности ДНК. Такие белки искусственно объединяют с эндонуклеазами для разрезания ДНК. Химерные эндонуклеазы на основе цинковых пальцев и белков TALE были названы ZFN (zinc finger nuclease) и TALEN (transcription activator-like effector nucleases).

Домены ZFN и TALEN, узнающие определенные последовательности нуклеотидов, состоят из большого числа аминокислот. Гораздо проще манипулировать с короткими sgRNA, в которых одна «буква» спейсера соответствует одной «букве» ДНК-мишени. Именно простота использования CRISPR-Cas стала главным преимуществом этих систем в сравнении с более ранними подходами.

Но даже это не предел. Ещё в 2015 году исследователи из Массачусетского технологического института (США) сообщили об эндонуклеазе Cpf1, которая действует аналогично белку Cas9, но не требует tracrRNA для разрезания мишени. Таким образом, система может стать ещё компактней, а значит, повысится эффективность её доставки.

Перспективным применением молекулярных ножниц CRISPR-Cas9 является разработка методов лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Заражая клетки иммунной системы, вирус встраивает свой геном в ДНК хозяина. Для проникновения в лимфоциты вирус использует особые рецепторы, расположенные на поверхности клеток. Эти рецепторы кодируются геном CCR5. Среди людей встречаются обладатели мутантной аллели CCR5-delta32. Таким образом, у них есть естественный иммунитет против ВИЧ. 

Уже давно была продемонстрирована эффективность CRISPR-Cas для редактирования гена CCR5 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК). Такие клетки затем могут превратиться в любые другие соматические в теле пациента, например, в лимфоциты, устойчивые к ВИЧ.

Мария Попцова,
доцент Департамента больших данных и информационного поиска,
заведующая Научно-учебной лабораторией
биоинформатики факультета компьютерных наук НИУ ВШЭ

Читать комментарий

Нобелевскую премию за редактирование генома ожидали уже лет пять. Получилось почти как с Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком, которые опубликовали статью в 1953, а премию получили девять лет спустя в 1962-м. Шарпентье и Дудна получили премию через восемь лет после оригинальной публикации. Метод CRISPR-Cas9 уже давно активно используется. С момента его открытия обсуждаются этические вопросы редактирования эмбрионов человека. Первый шаг в лечении заболеваний уже сделан — в декабре 2017 Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) разрешила генную терапию на основе редактирования генома для лечения редкой формы врожденной слепоты, которая доставляется во взрослое тело. Практические применения данной технологии от сельского хозяйства до медицины бесчисленны.

Хотя метод опубликован и является общественным научным достоянием, в США идет битва за патент между двумя сильнейшими университетами — Гарвардом и Университетом Калифорнии в Беркли. Кроме того, сама Эммануэль Шарпентье является сооснователем компании CRISPR Therapeutics, а Дженнифер Дудна вообще владеет двумя компаниями. Первая — Mammoth Biosciences — занимается разработкой теста на COVID-19 с помощью технологий CRISPR. Вторая компания Scribe Therapeutics планирует разрабатывать клинические приложения CRISPR.

Метод CRISPR-Cas9 основан на использовании системы защиты бактерий от вирусов в клетках эукариот (не бактерий). Тем не менее, он не единственный и в скором времени должны быть открыты другие методы редактирования генома — более точные. Будем следить за развитием науки.

Ещё более перспективное направление, но вызывающее постоянные дискуссии об этике — редактирование человеческих эмбрионов с помощью CRISPR-Cas9. Ещё весной 2015 года биологи из Университета Сунь Ятсена проделали это впервые в мире. Команда Хуана Цзюньцзю применила технологию к оплодотворенным яйцеклеткам человека с целью замены гена, связанного с наследственным заболеванием талассемией (нарушение синтеза гемоглобина, разрушение эритроцитов и анемия). 

К сожалению, результаты оказались катастрофическими — из 86 обработанных зигот процедуру пережила 71. Только в 28 из них ферменты произвели точный разрез ДНК и лишь в четырёх клетках здоровая копия гена успешно заменила исходную. Несмотря на удручающие итоги, это исследование дало старт новым экспериментам как в Китае, так и в других странах, включая Россию. 

В 2018 году Цзянькуй Хэ из Южного университета науки и технологий в Шэньчжэне объявил о рождении девочек-близнецов Лулу и Наны, у которых помощью технологии CRISPR-Cas9 как раз и был искусственно изменен ген, отвечающий за восприимчивость к ВИЧ — CCR5. Зиготу, полученную в результате оплодотворения яйцеклетки матери сперматозоидом ВИЧ-инфицированного отца, модифицировали. А затем эмбрион была подсажен матери с помощью стандартных методов, используемых при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО).

В конце 2019 года похожие манипуляции собирался провести российский учёный Денис Ребриков, с той лишь разницей, что лечить он собирался наследственную глухоту. Однако удалось ли ему получить оплодотворенную яйцеклетку от донора или нет, так пока и неизвестно. Разразившаяся пандемия COVID-19, вероятно, внесла корректировки в исследовательские планы.
IQ

Автор текста: Кузнецов Даниил Александрович, 21 октября, 2020 г.