Фоторобот для вирусов

В издательстве «Альпина нон-фикшн» вышла книга молекулярного биолога и научного журналиста Ирины Якутенко «Вирус, который сломал планету. Почему SARS-CoV-2 такой особенный и что нам с ним делать». IQ публикует из неё сокращённую главу, в которой автор разбирает существующие виды тестов на COVID-19, их особенности — и объясняет, как они разрабатываются, проверяются, и почему некоторые из них могут ошибаться.

В феврале 2020 года большинство людей смеялось над паникёрами, сообщавшими, что в Китае все плохо и нужно готовиться к пандемии, но уже в марте количество запросов «где сдать тест на коронавирус» резко пошло вверх. И чем дольше мы существуем с COVID-19, тем очевиднее, что без массового тестирования невозможно сдерживать вирус, сохраняя при этом подобие нормальной жизни. Если правительства не понимают, сколько на самом деле людей инфицировано SARS-CoV-2 и какова динамика числа заболевших, они не могут вводить адекватные сдерживающие меры — или, наоборот, снимать ограничения. Недооценив количество зараженных, легко просчитаться с оборудованием больниц и палат реанимации, переоценив — угробить экономику чрезмерно длительным карантином.

Первый тест, позволяющий определить, болен ли человек COVID-19, появился уже в середине января 2020-го (тогда болезнь называли 2019-nCov). И сделали его не в Китае, как можно было бы подумать, а в Германии: протокол выявления РНК вируса в мазках из глотки разработали исследователи Института вирусологии при берлинской клинике «Шарите».

Руководитель группы — директор этого института Кристиан Дростен много лет изучал вирусы SARS и MERS и в том числе разрабатывал тест-системы для их выявления. Именно поэтому, как только китайские ученые выложили первые расшифрованные геномы нового коронавируса, Дростен и его коллеги смогли быстро подготовить протокол определения SARS-CoV-2. Они передали его ВОЗ, и та выложила инструкции по изготовлению тест-систем на сайте, чтобы учёные и медики в других странах смогли быстро создать собственные тесты. С тех пор их количество увеличилось до нескольких десятков, и сегодня можно провериться «на корону» множеством самых разных способов: от «серьезных» лабораторных анализов до домашних тест-полосок вроде тех, которыми выявляют беременность. 

Начнём с разделения двух основных видов тестов: на РНК вируса и на антитела к нему (на самом деле есть ещё тесты на антигены коронавируса — эта разновидность быстрых тест-систем только входит в практику; мы еще поговорим о ней ниже).

РНК-тесты

Попав в клетку, SARS-CoV-2 синтезирует новые вирусные частицы, заставляя клеточные ферменты считывать информацию, записанную в его геноме. Белки вируса не похожи на человеческие, а значит, его можно выявить, обнаружив в клетках нетипичные для Homo sapiens последовательности нуклеотидов, кодирующих эти белки. 

Именно так работает генетический тест на коронавирус: из соскоба клеток, обычно из рото- или носоглотки, выделяют нуклеиновые кислоты, а затем определяют, есть ли среди них те, которые принадлежат не человеку, а коронавирусу. Но даже в образце зараженного SARS-CoV-2 слишком мало «неправильных» нуклеиновых кислот, чтобы их можно было обнаружить напрямую (вопреки тому, что показывают в фильмах и сериалах про больницы, рассмотреть ДНК или РНК из образца в настольный микроскоп нельзя). Поэтому ученые придумали хитрую технологию: они многократно копируют отдельные кусочки вирусного генома до тех пор, пока их можно будет буквально увидеть глазами, если особым образом покрасить нуклеиновые кислоты. 

В 1993 году изобретатель этой реакции — американский биохимик Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии. Метод называется ПЦР (полимеразная цепная реакция), и он полностью перевернул молекулярную биологию: фактически именно благодаря ПЦР началась эта наука в современном её понимании. За создание копий отвечает фермент полимераза. Она садится на нить ДНК или РНК, по одной считывает записанные в ней буквы-нуклеотиды и строит вторую нить, которая повторяет первую.

Вторая нить не идентична первой: она ей комплементарна. Нуклеотиды как ДНК, так и РНК легко «спариваются» друг с другом: А (аденин) образует пару с Т (тимином), а Г (гуанин) с Ц (цитозином). Соответственно, если полимераза видит последовательность ААТТГГЦАЦ, она построит новую нить ТТААЦЦГТГ. В случае РНК вместо тимина пару с аденином образует урацил (У).

Этот процесс проводят много раз. Для того чтобы полимераза размножала не все имеющиеся нуклеиновые кислоты, а только нужный кусочек, учёные указывают ей, какой фрагмент воспроизводить, при помощи праймеров. Это небольшие отрезки ДНК, которые прилипают к выбранному исследователями месту на копируемой нити. Два праймера с двух сторон ограничивают участок, который должен быть размножен, примерно как таблички с названием населённого пункта на дороге указывают его границы.

Участок для копирования внимательно выбирают так, чтобы он присутствовал только в геноме вируса: так как фрагмент небольшой, может случайно получиться, что очень похожий кусочек будет и в ДНК хозяина. Кроме того, этот фрагмент должен быть достаточно консервативен, чтобы не мутировать каждые пять минут, и при этом отличаться от аналогичных мест в геномах вирусов-родственников.

Для того чтобы все получилось и размножились только нужные нам участки, очень важно правильно подобрать праймеры. Они могут плохо липнуть к желаемому участку или прилипать не только к нему, но и к какому-нибудь месту в геноме хозяина или других коронавирусов, и тогда полимераза будет умножать его, а тест — давать ложноположительный ответ.

Важен и размер праймеров: слишком короткие будут неизбирательно приставать ко множеству неправильных мест, а специфичные, но слишком длинные могут частично приклеиваться к неправильному участку ДНК — и этого участка будет достаточно, чтобы полимераза начала синтез. В общем, подбор удачного фрагмента и праймеров — тонкое дело, и найти удачную комбинацию удается не всегда. Обычно останавливаются на отрезках, кодирующих какие-нибудь важные сервисные белки, которые обеспечивают собственные нужды вируса. И чаще всего тест-системы выявляют фрагмент не одного белка, а нескольких — такой дизайн практически исключает вероятность кросс-реактивности с похожими вирусами. Тест-системы на SARS-CoV-2 обычно выявляют кусочки генов N- и S-белков.

Если в соскобе с глотки есть вирусная РНК, после того как учёные выделят нуклеиновые кислоты, добавят праймеры и полимеразу и много раз проведут реакцию копирования, в пробирке накопится изрядное количество тех самых заранее выбранных кусочков вирусного генома, и их можно будет детектировать. Если же образец чист, полимераза не сможет ничего размножить, так как праймерам, указывающим ей участок, который нужно копировать, будет некуда приклеиться.

В случае с SARS-CoV-2 есть ещё одна проблема: его геном записан на молекуле РНК, а ПЦР можно проводить только с молекулами ДНК. Поэтому на первой стадии теста выбранный фрагмент РНК превращают в ДНК, используя фермент обратную транскриптазу, или РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Изначально этот фермент тоже был выделен из вирусов. Конкретно — из ретровирусов, которым он необходим, чтобы перевести свой РНК-геном на язык ДНК и встроить в геном клетки-хозяина (SARS-CoV-2 так делать не умеет!). РНК-зависимая ДНК-полимераза садится на нить РНК и строит её ДНК-копию. Место посадки ферменту опять же указывают праймеры.

Но и это ещё не всё. Полностью реакция, которую проводят при генетическом тесте на коронавирус, называется ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Такой тип исследования позволяет увидеть, на каком именно цикле умножения ДНК-копий появляется сигнал. По этому параметру можно приблизительно оценить исходное количество РНК в образце, и, главное, результат анализа виден сразу. При проведении классической ПЦР требуется ещё один шаг для визуализации размноженных ДНК-фрагментов.

Итак: учёные проверяют, есть ли в исследуемом образце фрагменты генов вирусных белков. То есть положительный результат генетического теста не говорит, что в глотке человека или в смыве с какой-то поверхности присутствует активный живой вирус, — наличие сигнала свидетельствует лишь, что в образце имеется вирусная РНК. Делать вывод о заразности человека или поверхности только по результатам ПЦР-теста нельзя: вирус может быть давно мертвым или же его количество недостаточно для передачи.

Впрочем, есть способ оценить, свидетельствует ли результат генетического теста о наличии живого вируса в концентрации, достаточной для заражения. Чтобы выяснить это, необходимо внимательно посмотреть на параметры ПЦР-реакции, при которых был получен положительный сигнал. Так как для выявления РНК SARS-CoV-2 используется не просто ПЦР, а ПЦР в реальном времени, мы не только видим сигнал или его отсутствие по итогам нескольких раундов умножения копируемого фрагмента ДНК, но можем сказать, на каком именно раунде (учёные говорят «цикле») он появился.

На каждом цикле количество целевых фрагментов в образце удваивается, и, если их изначально много, полимераза синтезирует достаточное для выявления число копий быстро, то есть за небольшое число циклов. Если исходно в пробирке было мало нитей вирусной РНК (а значит, и синтезированной с них ДНК), потребуется больше циклов удвоения. Соответственно, если мы видим положительный сигнал, скажем, на 34-м цикле, это означает, что исходно РНК в образце очень мало и человек, вероятнее всего, уже — или ещё — не заразен. Появление сигнала на 25-м цикле указывает, что РНК очень много, то есть вылетающие изо рта капли слюны содержат большое количество живого вируса и человек вполне может эффективно заражать окружающих.

У не болеющих прямо сейчас и контактировавших с больными за доказательство чистоты принимают отрицательный результат одного теста. У тех, кто болел, критерием выздоровления считают два отрицательных результата, полученных с интервалом в несколько дней при отсутствии клинических симптомов.

Впрочем, постепенно от этой практики отказываются, и если у человека с подтвержденной ранее коронавирусной инфекцией с момента появления симптомов прошло более десяти дней, а сами симптомы исчезли, его могут вычеркнуть из списка болеющих и без второго теста. Отсутствие симптомов критически важно: так как по мере прогрессирования болезни SARS-CoV-2 спускается из верхних дыхательных путей в нижние, на второй-третьей неделе болезни вирусная РНК в мазках из глотки может не определяться, хотя коронавирус замечательно размножается в легких и может загнать пациента в реанимацию. Самое неприятное, что эту ошибку (приравнивать отрицательный тест к отсутствию вируса в организме, а положительный — к его наличию) часто допускают в исследовательских статьях. Именно по этому так важно вчитываться в детали проведенных экспериментов, а не только в громкие заголовки публикаций в СМИ.

Тест на антитела

Если РНК-тест выявляет активную стадию болезни, то серологический, он же тест на антитела, показывает, перенёс ли человек COVID-19 в прошлом — хотя иногда может выявлять и текущую инфекцию. Когда в нас проникает патоген, организм мобилизует для защиты от него иммунную систему. Если повезёт, она задавит врага силами врождённого иммунитета, которые неспецифично убивают самых разных «вторженцев». И только когда это не поможет, начинает раскручиваться махина адаптивного иммунитета, настраивающегося конкретно на этого паразита. Важнейшими игроками этой системы являются антитела — белковые молекулы, которые накрепко прилипают к какому-нибудь месту на поверхности патогена, маркируя его для клеток-пожирателей вроде макрофагов.

Первыми появляются антитела типа М — они связываются с врагом не очень прочно и не слишком специфично. Иммуноглобулины типа G подтягиваются позже, так как им требуется время, чтобы «созреть»: благодаря хитрому процессу локальных мутаций в производящих эти антитела B-лимфоцитах каждое следующее поколение IgG прочнее прикрепляется к антигену.

Вероятнее всего, IgA тоже появляются относительно рано, но про их динамику мало что известно, поэтому для диагностики тестирование на них не используют.

Однако в случае коронавируса разница в появлении IgM и IgG не слишком велика: оба типа антител начинают обнаруживаться в крови к концу первой недели после появления первых признаков COVID-19. Но на этом этапе концентрация иммуноглобулинов слишком мала: стандартные массовые тесты стабильно определяют оба типа антител начиная с 14-го – 21-го дня. Концентрация IgG и IgM увеличивается со временем (хотя и с разной скоростью) и выходит на плато примерно на 17-й –19-й день после появления симптомов.

Для того чтобы определить, есть ли в организме антитела к коронавирусу, у тестируемого берут кровь, отделяют сыворотку и капают её в маленькую лунку на специальной прозрачной пластиковой плашке. В стандартной плашке 96 лунок, и ко дну каждой заранее приклеены антигены — в данном случае фрагменты различных белков SARS-CoV-2 (чаще всего используют фрагменты S- и N- белков). Если в сыворотке есть антитела против вирусных белков, они намертво прицепятся к антигенам в лунке. 

На следующем этапе плашку промывают от несвязавшихся иммуноглобулинов, а затем добавляют в лунки так называемые вторичные антитела, узнающие «ножки» любых человеческих антител: так как в плашке остались только антитела против белков коронавируса, вторичные антитела прицепятся именно к ним. 

Вторичные антитела модифицированы так, что их можно визуализировать: скажем, к их ножкам прикрепляют ферменты, которые при добавлении определенных веществ могут флуоресцировать. Через прозрачное дно плашки хорошо виден цветовой сигнал, и если он есть, значит, в исходном образце были антитела к белкам SARS-CoV-2. Такой метод определения каких-либо антигенов называется иммуноферментным анализом (ИФА) или, по-английски, ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой).

Если с чувствительностью ПЦР-теста можно поиграть, выбирая для размножения тот или иной участок вирусного генома, то в случае серологических тестов важно, какие антигены будут закреплены на дне лунки. Когда там слишком много разных фрагментов, велика вероятность, что мы обнаружим антитела не только к SARS-CoV-2, но и к другим коронавирусам. У них много похожих белков, а небольшие пептидные фрагменты и вовсе могут оказаться одинаковыми. Тесты, которые плохо определяют отличия между близкими вирусами, называют малоспецифичными. Если ограничиться малым числом кусочков, тест, наоборот, может давать ложноотрицательный результат, потому что у человека не сформировались антитела именно к этим фрагментам. Говорят, что у таких тестов низкая чувствительность.

Раз отмучился — и всё?

В прессе можно прочитать, что наличие антител к коронавирусу свидетельствует об иммунитете: раз у человека есть защитные антитела, они немедленно задавят вирус, если он ещё раз попытается попасть в организм. В случае SARS-CoV-2 однозначно делать подобный вывод рано. 

Во-первых, среди сформированных антител может не быть нейтрализующих, то есть тех, которые способны одолеть вирус в одиночку, связываясь с тем участком, при помощи которого он проникает в клетки. Без таких антител защита неполна, потому что патоген хоть и в меньших количествах, но всё же будет заражать клетки. 

Во-вторых, мы пока не знаем, насколько велик вклад антительной и Т-клеточной ветвей иммунитета в дело победы над коронавирусом. Если Т-клеточная компонента важнее, то сам по себе факт наличия антител не гарантирует защиты, потому что мы не знаем, есть ли у человека достаточно активированных Т-клеток. 

Наконец, появляется всё больше данных, что титр антител подозрительно быстро снижается со временем, причем чем меньше изначальный титр, тем быстрее он падает ниже уровня обнаружения (впрочем, часть подобных сообщений могут быть связаны с ошибками тестирования, особенно если у испытуемых изначально наблюдался низкий титр антител: нельзя исключать, что они не болели COVID-19, но их первый тест был ложноположительным). Обычно высокий титр связан с тяжестью инфекции: он выше у людей с более выраженными симптомами. В небольшом исследовании, проведенном в Великобритании, у пациентов, которые перенесли COVID-19 в легкой форме, титр антител падал до необнаружимого уровня уже через 50 дней после начала заболевания. У тех, кто как следует помучился от «короны», антитела детектировались, но тенденция была одинаковой у всех категорий инфицированных: количество антител в крови неумолимо уменьшалось с каждой неделей.

Такая динамика не похожа на ту, что наблюдалась у перенесших SARS — атипичную пневмонию, вызванную более злобным родственником нынешнего коронавируса. Титр антител в крови выздоровевших тоже падал со временем, но даже спустя три года их всё еще можно было определить,. Возможна или нет реинфекция SARS, мы не знаем: вирус исчез, так что у переболевших нет шансов встретиться с ним повторно. Зато для коронавирусов, вызывающих сезонные простуды, реинфекция даже в течение того же года, похоже, вполне типична, и антитела к ним вымываются из крови стремительно. Пока характер угасания антител у переболевших COVID-19 гораздо больше напоминает именно мягкие коронавирусы. Да и по характеру течения новая коронавирусная инфекция к ним гораздо ближе — и это ещё одно косвенное свидетельство, что титр антител не будет долгоиграющим.

Как часто ошибаются тесты?

Чувствительность и специфичность — два главных параметра, которые определяют ценность теста в качестве диагностического инструмента. Говоря простым языком, именно от них зависит, насколько можно доверять его результатам. 

Когда тест не находит заболевание у тех, кто болеет, — это низкая чувствительность. Когда находит у того, кто здоров, — низкая специфичность. Эти два параметра обратно связаны друг с другом: увеличивая одно, мы неизбежно занижаем другое. Обычно тесты, используемые для диагностики заболеваний, выкручивают на максимум чувствительности. Потому что мы хотим обнаружить всех носителей, а в случае генетического теста на COVID-19 ещё и изолировать их, чтобы прервать как можно больше возможных цепочек заражения.

В тестах на антитела к SARS-CoV-2 разумнее увеличивать специфичность: если тест будет выдавать положительный результат всем, кто недавно болел простудой коронавирусного происхождения, мы будем думать, что в обществе существенно больше перенесших COVID-19, чем на самом деле. Исходя из этих цифр, политики могут решить, что тот самый коллективный иммунитет уже близок, ослабить меры предосторожности и не держать резервных коек в больницах — ведь почти все уже переболели. Отвлекаясь даже от факта, что мы не знаем, гарантирует ли наличие антител к белкам SARS-CoV-2 длительную защиту от повторного заражения, резкое ослабление мер в популяции, где большинство вовсе не встречалось с вирусом, неизбежно даст всплеск заболеваемости.

Чувствительность большинства используемых сейчас тестов на антитела колеблется около цифры 99%. Разброс по специфичности больше — он составляет в среднем от 90% до почти 100%. Кажется, что это неплохие показатели, но в действительности все не так радужно. Да, сами по себе эти значения вполне приличные, но для массового скрининга (тотальной проверки), особенно в популяции, где не очень много людей переболело COVID-19, они не так уж хороши. Чтобы понять, как общее число переболевших влияет на пригодность теста, хотя сам он при этом не меняется, рассмотрим конкретный пример.

Представим, что в некоей популяции — пускай это будет Москва — COVID-19 переболели 5% жителей (для простоты будем считать, что у всех у них теперь есть антитела). Пускай у нас есть тест на антитела с чувствительностью 99% и специфичностью 98%. Мы наугад выбрали 1000 человек и собираемся проверить их нашим тестом. Если выборка совершенно случайная, 5% — то есть 50 человек — имеют антитела к SARS-CoV-2. Так как чувствительность теста не 100%, а только 99, 1% из реально переболевших получат ложноотрицательный результат. 1% от 50 человек — это 0,5 человека. Казалось бы, никакой разницы. Но продолжим наши рассуждения. Специфичность теста 98%, то есть 2% из тех, кто не болел COVID-19, получат ложный результат, будто они болели. В нашей тысяче москвичей не болели 95%, то есть 950 человек. 2% от 950 — это 19 человек, которым сообщат, что у них есть антитела к коронавирусу, хотя на самом деле их нет. 

Теперь важный момент: в реальности сотрудники лаборатории не знают, у кого из тех, кто признан переболевшим, реально есть антитела, — это знаем только мы как авторы этой задачки. Но клиницисты могут подсчитать, какова вероятность, что любой из полученных положительных результатов — ложный. Для этого нужно разделить число тех, кто получил положительный результат ошибочно, на общее число положительных результатов. В нашем случае это 19 человек, а всего узнали, что они перенесли коронавирусную инфекцию, 19+49,5=68,5 человека. 19/68,5=0,27, то есть 27%. Другими словами, больше четверти положительных результатов в реальности являются ложноположительными.

Теперь представим, что в Москве переболело 50% населения. Тогда, повторив наши рассуждения, мы получим, что лишь чуть меньше 2% положительных результатов тестов на COVID-19 окажутся неверными. С ростом доли переболевших знаменатель дроби в формуле, по которой мы рассчитываем вероятность ошибки, становится всё больше, а значит, результат деления — всё меньше. Другими словами, значимость положительного и отрицательного результатов теста (а следовательно, пригодность этого теста для массовых скринингов) зависит от того, насколько широко распространено изучаемое заболевание. 

Для вас лично из этой абстрактной математической закономерности вытекают два практических следствия. Чем меньше людей реально переболели COVID-19, тем выше вероятность, что ваш положительный результат неверен (ни у кого ещё нет антител, а у меня уже есть, наверно, это какая-то ошибка). И наоборот, чем переболевших больше, тем значительнее шанс, что, если вы получили отрицательный результат, он будет ложным (у всех уже есть антитела, а у меня нет, как так, это явно ошибка).

Чтобы оценить диагностическую ценность положительного (PPV, positive predictive value) и отрицательного (NPV, negative predictive value) результата, не проводя вручную все те расчеты, что мы проделали выше, учёные и медики используют специальные формулы, учитывающие чувствительность и специфичность конкретного теста и прикидочную распространенность заболевания (ведь точную мы не знаем, потому что идеальных тестов, которые бы давали нулевую ошибку, не существует). 

Для наших примеров с 5% и 50% процентами переболевших в Москве диагностическая ценность положительного результата теста с чувствительностью 99% и специфичностью 98% составляет соответственно 72% и 98%. То есть, когда вокруг болеет мало народу, шанс, что человек, который получил положительный результат, действительно перенес COVID-19, составляет примерно 7 из 10. Когда переболел каждый второй, положительный результат — это почти гарантированно истинный «плюс». Диагностическая ценность отрицательного результата составляет при 5%-ной распространенности 99,9%, при 50%-ной — 98,9%. Если в нашей гипотетической Москве переболеет 80% жителей, диагностическая ценность отрицательного результата всё равно составит уверенные 96%, а положительного — 99%.

Учитывая все эти сложности, возникает вопрос, как быть правительствам, когда в обществе мало переболевших коронавирусной инфекцией, а чувствительность и специфичность имеющихся тестов не позволяют считать получаемые ответы достоверными. А также — что означает положительный или отрицательный результат лично для меня? Ответы разнятся для генетических и серологических тестов. Первые используются для выявления тех, кто болеет прямо сейчас, поэтому для них простительно быть менее специфичными, но более чувствительными. Однако по техническим причинам чувствительность РНК-тестов остаётся намного ниже теоретически возможной. Это происходит не из-за того, что врёт реакция ПЦР — она как раз очень чувствительна, — а по причине несовершенства сопутствующих процедур.

Как воспринимать РНК-тесты

РНК — очень капризная молекула и норовит развалиться при любом удобном случае. Если лаборант, который берёт мазок, проводит тест или везёт образцы в лабораторию, немного нарушит протокол, к моменту, когда он добавит в пробирку реактивы для проведения ОТ-ПЦР, там останутся только ошметки вирусных геномов. Кроме того, не все могут правильно взять мазок из носоглотки — по этой причине сомнительной идеей кажутся домашние РНК-тесты, требующие этой процедуры. В одной из работ авторы определяли вирус в разных типах образцов, и мазок из глотки давал истинно положительный результат лишь в 32% случаев. Самым точным — 93% — был анализ жидкости, полученной из легких (бронхоальвеолярный лаваж), но, чтобы её добыть, необходимо проводить крайне неприятную процедуру под местной анестезией. Для массового применения такой метод очевидно не подходит.

Наконец, критически важно время взятия проб: при длительном течении болезни вирус спускается в легкие, и мазок из глотки в этом случае часто показывает отрицательный ответ. Как и сразу после заражения. ПЦР-диагностика в принципе даёт результаты с хоть насколько-то приличной степенью достоверности лишь в дни вокруг появления симптомов. В первые дни после заражения, пока патоген инфицировал ещё не очень много клеток, его легко пропустить. По мере роста числа заражённых клеток концентрация вируса начинает резко увеличиваться — она растёт по экспоненте. Человек максимально заразен за день до появления симптомов, то есть концентрация вирусных частиц в верхних дыхательных путях в эти дни максимальна и не заметить SARS-CoV-2 в пиковые дни его размножения в глотке очень сложно.

Описанная выше ситуация с ПЦР-тестами выглядит довольно безрадостно: низкая точность, много ложноотрицательных результатов, бесконечно долгая логистика, нехватка тестов для массовых проверок, высокая цена (ОТ-ПЦР — дорогое удовольствие, так как требует не только приборов и реактивов, но ещё и обученного персонала). Складывается впечатление, что генетическое тестирование в принципе непригодно для массового скрининга и быстрого выявления потенциальных носителей, особенно в ситуациях, когда за день в городе обнаруживаются не два десятка, а 10 000 новых носителей, как было, например, на пике в Нью-Йорке. Но для того чтобы школы, сады, университеты, офисы и заводы могли вернуться к полноценной работе, тестирование должно быть именно массовым.

Теоретически можно довести процедуру ПЦР-тестирования до ума, нанять новых лаборантов, как следует переобучить старых и прикомандировать их к большинству крупных учреждений, предварительно закупив туда оборудование, реорганизовать системы забора и анализа образцов, чтобы уменьшить время обработки тестов и так далее. Но подобная стратегия радикально увеличивает финансовую нагрузку на государства, а они сейчас и так не в лучшем экономическом положении.

Парадоксальным образом путь к решению может пролегать ровно в обратном направлении. Не нужно гнаться за сверхточными тестами, которые крайне чувствительны к методологическим огрехам и выдают результат спустя несколько дней из-за сложной логистики. Такие тесты хороши, если наша цель — дать каждому тестируемому достоверный ответ, является ли он прямо сейчас носителем вируса. Но если наша задача — не допускать новых вспышек, такая индивидуальная точность не нужна. Достаточно выявлять бóльшую часть носителей на стадии, когда они активно распространяют вирус и могут заражать других. Для этой цели отлично сгодятся и тесты, которые «видят» РНК, только когда её много — потому что её много как раз на стадии активного распространения вируса. Намного важнее точности скорость, с которой тест выдает ответ. Если использовать подслеповатые, но быстрые тесты достаточно часто, скажем раз в несколько дней, мы всё равно выявим бóльшую часть максимально заразных носителей. А отследив и изолировав их контакты, мы купируем потенциальную вспышку.

Быстрые тесты, основанные не на ОТ-ПЦР в реальном времени, существуют, однако массово не используются — не в последнюю очередь из-за того, что у надзорных органов имеются претензии к их чувствительности. Но в данном случае такая бдительность скорее вредна: в тестах для скрининга и тестах для индивидуальной диагностики важны разные качества, и пытаться использовать одни вместо других как минимум неоправданно, а как максимум вредно.

На раз, два, три

В кино про медицину врачи обычно проводят тесты так: берут у пациента образцы, капают в пробирку с ними загадочную жидкость — и сразу видят результат. В самых реалистичных фильмах пробирку могут поставить в какой-нибудь прибор. Настоящее тестирование на коронавирус такой кинематографичностью не отличается: это долгий и муторный процесс, проходящий в несколько стадий и требующий сложных приборов и квалифицированных лаборантов. Точнее, именно так выглядит золотой стандарт — ОТ-ПЦР в реальном времени. 

Но киношные тесты на SARS-CoV-2 тоже есть. Например, компания Abbott разработала тест-систему на основе так называемой реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP — Loop-mediated Isothermal Amplification) с обратной транскрипцией. Она позволяет проводить все необходимые этапы в той же пробирке, куда поместили образцы. 

ОТ-ПЦР в реальном времени требует переноса растворов из одной пробирки в другую, а это, во-первых, фактор риска неправильного результата, а во-вторых, такие протоколы может выполнять только обученный специалист. Коротко смысл реакции в том, что, благодаря хитрому подбору праймеров, на первых циклах реакции к целевому «умножаемому» фрагменту ДНК приделываются дополнительные краевые кусочки, которые сворачиваются в петли. ДНК-полимераза садится на эти петли и копирует содержащийся между ними фрагмент, а так как копия тоже содержит самосворачивающиеся концевые надстройки, процесс идёт до тех пор, пока в пробирке есть нуклеотиды для синтеза новых цепей. Довольно быстро в пробирке накапливается большое количество размноженных кусочков, которые можно увидеть, например, при помощи специального красителя, присоединяющегося к нитям ДНК.

Другой вариант быстрого теста — на антигены коронавируса — больше всего похож на тест для определения беременности. Он представляет собой полоску, на которую нанесены две дорожки — из антител к белкам коронавируса и антител к этим антителам. Кроме того, на край самой полоски тоже нанесены антитела к этим белкам, но они узнают другой фрагмент антигена (белка). На полоску капают разведенный в условном физрастворе соскоб или слюну и ждут, пока капиллярные силы подтянут жидкость к дорожкам. Если в образце есть достаточное количество вирусных частиц, антитела на краю полоски уцепятся за целевой белок и «приедут» к первой дорожке. Содержащиеся в ней антитела тоже узнают вирусный антиген и схватят его. При этом два типа антител окажутся физически близко друг к другу. На «первых» и «вторых» антителах закреплены особые молекулы, которые, соединившись друг с другой, дадут цветовой сигнал. Вторая дорожка содержит антитела к первым антителам и «половинку» вещества-красителя. Если в образце нет вирусных частиц, первые антитела дадут окрашивание только второй дорожки. Если же вирус есть, то окрасятся обе полоски.

Оба типа быстрых тест-систем позволяют получить ответ, есть ли в образце вирусная РНК или белки, за минуты. Однако у таких тестов высок процент ошибок из-за недостаточно высокой чувствительности — соответственно, лишь единицы из них одобрены для массового применения. Но при грамотном применении быстрых тестов сверхточность и не требуется.

Что касается индивидуальных решений, то наиболее ответственным поведением в условиях, когда тесты с высокой вероятностью могут выдать неверный результат, будет считать отрицательный ответ возможно ошибочным, а положительный — истинным. И если у вас «плюс» — не нужно ехать пересдавать тест и ходить в гости к бабушке, нужно сидеть дома, а через две-три недели сдать тест на антитела (для верности). Если делать тест «просто из интереса», в случае отрицательного ответа продолжайте соблюдать меры предосторожности (носить маску, соблюдать дистанцию). Если же вы озаботились тестом, потому что тесно контактировали с кем-то, кто позже заболел, лучше на всякий случай посидеть дома, а если это невозможно, то максимально соблюдать все меры предосторожности положенные две недели. Иными словами, если имеются подозрения, что вы можете быть носителем вируса, лучше перестраховаться.

Как воспринимать тесты на антитела

С серологическими тестами ситуация иная. Они выявляют не активных носителей вируса, а главным образом тех, кто уже переболел, особенно если мы говорим об иммуноглобулинах типа G. И так как мы пока не знаем, гарантируют ли антитела длительную защиту от повторного заражения, каков бы ни был результат теста, человек не должен менять свое поведение и переставать соблюдать меры предосторожности. 

В целом логично руководствоваться соображениями, которые мы обсудили выше: если заболевших в популяции мало, то, скорее всего, вы тоже пока не переболели. И отрицательный результат теста на антитела, вероятнее всего, достоверен, а вот положительный — повод сделать его ещё раз, причем лучше использовать не тот же самый, а разработанный другим производителем. Потому что неспецифичность теста часто связана с кросс-реактивностью к белкам других коронавирусов. В тесте другой фирмы в качестве антигенов может использоваться иной набор пептидных фрагментов, на которые ваши антитела к обычным коронавирусам не среагируют. Впрочем, есть и другие причины. Создатели тестов и использующие их медики жалуются, что ложноположительные результаты могут появляться, если у пациента повышенное содержание холестерина и в целом липидов, высокий гемоглобин и другие особенности биохимии.

Ещё один важный вопрос — количественным или качественным был серологический тест, который вы делали. По титру антител, особенно если у вас обнаружены и IgG, и IgM, можно сделать вывод о стадии болезни. Грубо говоря, если IgM достаточно много, вероятно, вы заразились недавно (но все равно опасности для окружающих, скорее всего, не представляете, так как стандартные тесты стабильно выявляют антитела не раньше 14-го дня после проявления симптомов). Если же количество IgM на грани обнаружения, а титр IgG при этом высокий, скорее всего, с момента заражения прошло много времени. Качественный или полуколичественный тест (такие тесты выдают не точную цифру, а превышение над условной нормой) определить точный титр не может, он только выявляет сам факт наличия антител. Поэтому имеет смысл поинтересоваться, какой именно тест используют в той лаборатории или поликлинике, где вы решили сдать анализ.

Для правительств ситуация сложнее. Результаты тестирования на антитела необходимы чиновникам, чтобы принимать решения, можно ли ослаблять ограничительные меры, и если да, то насколько. Но пока вирусом переболело мало народу, достоверность результатов серологических анализов низка (низка их диагностическая ценность). Особенно в том случае, если граждане сдают тесты исключительно на добровольной основе. Увы, но без принуждения выборка тех, кто проверил свой серологический ковид-статус, всегда будет смещенной: с большей вероятностью в лабораторию или поликлинику пойдут те, кто подозревает, что контактировал с инфицированными. А значит, итоговый результат окажется завышенным по отношению к популяции в целом. Кроме того, внутри любого государства заболевание распределено неравномерно: в регионах, где были массовые вспышки, переболело много людей, при этом в другие части страны, особенно малонаселенные, вирус мог и не добраться.

По этому бодрые заявления чиновников «По результатам добровольного серологического тестирования в стране Х переболело 15% населения» стоит воспринимать критически. Это аппроксимация, причем довольно грубая и некорректная. И если для мест вроде Бергамо или Нью-Йорка, где весной и летом прошлого года была настоящая ковид-катастрофа, подобные оценки хоть как-то близки к истине, то для городов и посёлков, где всё проходило относительно спокойно, они совсем не отражают реальность. Впрочем, в том же НьюЙорке относительное количество переболевших в бедном Бронксе летом было в три раза больше, чем в зажиточном Манхэттене.

Самым правильным с точки зрения статистики решением будет подождать, пока побольше народу заразится COVID-19. Когда доля болеющих и переболевших вырастет, возрастёт и диагностическая ценность результатов тестирования. Но это решение напоминает ответ математика из анекдота про людей на воздушном шаре — оно абсолютно точно и совершенно бесполезно.

Двух путешественников на воздушном шаре бурей отнесло в незнакомую местность. Опустившись на землю, воздухоплаватели увидели прохожего и задали ему вопрос, где они находятся. Тот ответил: «На воздушном шаре» — и ушел. «Я думаю, это был математик», — после некоторого молчания сказал один из путешественников. «Почему?» — спросил второй. «Его ответ абсолютно точен — и совершенно бесполезен».

Еще вариант — прицельно тестировать семьи, а точнее, людей, живущих вместе (в английском языке для их обозначения используется термин household, то есть «домохозяйство»). Так как все члены семьи близко контактируют друг с другом, можно предположить, что их ковид-статус будет одинаковым. А значит, если серологические тесты, скажем, папы, мамы и двоих детей оказываются положительными, вероятность, что все они достоверны, многократно повышается (математически это выражается в перемножении вероятностей ошибочного ответа; так как все они меньше единицы, итоговый результат оказывается очень маленьким). Недостаток такой стратегии — четыре результата придется записать как один, а значит, для получения репрезентативной статистики нужно обследовать в четыре раза больше народу.

Ещё одна сложность: некоторые люди по не до конца ясным причинам не заболевают COVID-19 даже при близком контакте с носителем. Иными словами, если результат папы, мамы и сына окажется положительным, а дочери — отрицательным, придётся тестировать всех ещё раз (причем желательно при помощи другого теста), чтобы выяснить, кроется ли причина разных результатов в особенностях иммунитета дочери или в ошибке теста.

Третья стратегия — обязательное тестирование, причем не равномерное, а сгруппированное по районам, так, чтобы набранные добровольцы представляли собой достоверную выборку для конкретного места. Причем идеально проводить нарезку регионов не формально, а учитывая реальную кластеризацию, не важно, географическую или имущественную. Условно, если граница района или округа пролегает посередине жилого массива, так, что разницы в условиях жизни справа и слева от границы нет, жителей двух этих округов следует считать вместе.

С другой стороны, в рамках одного и того же округа могут выделяться существенно различные по уровню и условиям жизни районы. Например, ортодоксальные еврейские общины в Израиле мало похожи на соседние светские районы, а в Москве образ жизни радикально меняется от центра к окраинам. Такой метод позволяет выявить наиболее затронутые эпидемией регионы, а при регулярном тестировании ещё и отследить динамику распространения вируса. Но в демократических странах не существует законного способа заставить людей сдавать кровь, так что приходится рассчитывать на сознательность, а она далеко не всегда так высока, как хотелось бы.

Хорошая новость в том, что постепенно тесты становятся лучше (если, конечно, государства не ограничивают конкуренцию, закупая какой-нибудь один вариант для массового тестирования и не давая таким образом развиться конкурентам). Первые наборы, которые появились на рынке в начале весны, часто работали плохо, а доля неправильных результатов достигала 70%, а то и 95%(!). В основном это были китайские тесты неизвестных производителей, но в условиях, когда во многих странах Европы число заболевших росло по экспоненте, у правительств не было особого выбора и они закупали сомнительные тесты десятками тысяч. Нередко после проверок приходилось все их выбрасывать, как, например, в Испании, которая в марте выяснила, что 58 000 закупленных в Китае тестов дают правильный ответ с точностью 30%. К лету 2020 года развитые страны более или менее наладили выпуск собственных наборов, да и в целом их качество выросло.

Но как бы то ни было, регулярное и массовое тестирование, как генетическое, так и серологическое, — необходимый инструмент для сдерживания эпидемии и принятия адекватных управленческих решений. РНК-тесты нужны, чтобы вовремя выявлять и изолировать носителей вируса, не допуская развития новых вспышек, а тесты на антитела помогают понять, насколько успешными были меры по сдерживанию болезни и стоит ли их продлевать или ослаблять. Кроме того, результаты серологических исследований позволяют уточнить, каковы на самом деле летальность SARS-CoV-2 — отношение числа умерших к числу заразившихся — и доля тяжелых больных. И разумеется, без статистики по переболевшим невозможно делать адекватные прогнозы, как будет развиваться эпидемия и когда всё это безобразие закончится.
IQ

11 февраля, 2021 г.